ibb娱乐彩票
上海代寫論文網專業提供代寫畢業論文、代寫本科論文服務

相關文章推薦

聯系方式
您現在的位置:首頁 > 農業論文 > 畜牧獸醫論文 >
對研究山銀花黃芩材料與方法
發布時間:2018-03-21


  本篇文章目錄導航:

  【題目】山銀花黃芩提取物對肉雞生長的影響
  【第一章】山銀花黃芩的化學成分和藥理作用研究前言
  【第二章】對研究山銀花黃芩材料與方法
  【第三章】提取物對肉雞成長影響的結果
  【第四章】討論山銀花和黃芩提取物的應用
  【第五章-參考文獻】植物提取物的作用研究結果

2材料與方法
  
  2.1材料
  
  2.1.1試驗藥品

  
  山銀花黃芩提取物,由愛迪森(北京)生物科技有限公司提供,批號:1302261.含量:每1g山銀花提取物以綠原酸(C16H18O9)計,含量為2.40mg;每1g含黃芩提取物以黃芩苷(C21H18O11)計,含量為24.0mg.
  
  阿司匹林泡騰片:購自阿斯利康制藥有限公司,批號:1209021.規格:0.5g/片。
  
  二甲苯,購自北京化工廠,純度>99%,批號:20121203.
  
  博落回散(主要是血根堿、白屈菜紅堿),購自湖南美可達生物資源有限公司,產品批準文號:獸藥字(2012)180415250.批號:20130205.
  
  10%氧氟沙星溶液,購自北京普爾路威達獸藥有限公司,批號:1310041J.
  
  10%氧氟沙星可溶性粉:由愛迪森(北京)生物科技有限公司提供,批號:121121.
  
  2.1.2實驗動物及飼養管理
  
  4~6周齡清潔級昆明種小白鼠(體重20±2g)210只,SD大鼠(體重200±20g)30只,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,雌雄各半,飼養條件:室溫(22~25℃),相對濕度為65%±5%,12h明暗交替照明,自由進食、飲水。
  
  1日齡愛拔益加(AA+)肉仔雞公雛420只,購于北京昌平愛拔益加孵化場。試驗雞均飼養于標準雞舍,自由采食、飲水,飼養密度控制為15只/m2,按照常規方法飼養管理,試驗期間執行嚴格的防疫消毒措施。
  
  7日齡,接種新-支二聯活疫苗;14日齡,接種法氏囊疫苗。
  
  2.1.3菌株、試劑和培養基金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌株由北京生泰爾科技股份有限公司研究院提供。
  
  血液脂質代謝指標、血液抗氧化指標采用南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定,嚴格按照說明書進行操作。
  
  血清免疫球蛋白,采用購自哈爾濱賽萊博公司試劑盒測定。
  
  營養肉湯,普通肉湯瓊脂培養基購自北京陸橋技術股份有限公司。
  
  2.1.4主要實驗儀器與設備
  
  生物安全柜:BSC-1100ⅡA2-X,青島海爾生物醫療設備公司
  
  超凈工作臺:Theme Scientific 1829.SN.
  
  17069-15CO2恒溫培養箱:3000T型,美國REVCO公司
  
  PH計:sartorius PB-10,賽多利斯科學儀器有限公司
  
  移液器:Thermo Fisher公司
  
  電子天平:FA1004N,上海精密儀器儀表有限公司
  
  低溫臺式高速離心機:Beckman Avanti TM 30中國貝克曼庫爾特商貿有限公司
  
  進口電熱恒溫培養箱:DNP-9162型,上海精宏實驗設備有限公司
  
  電熱恒溫水槽:DK-80型,上海精宏實驗設備有限公司
  
  顯微鏡:OLYMPUS LMT-2型由日本OLYMPUS公司
  
  生產微孔濾膜:0.22?m,南京禾汽化玻儀器有限公司
內雞
  
  2.2試驗方法
  
  2.2.1山銀花黃芩提取物的抗炎抑菌作用試驗
  
  2.2.1.1山銀花黃芩提取物抗二甲苯致小鼠耳廓腫脹試驗

  
  分別稱取山銀花黃芩提取物,以去離子水溶解制得濃度為256mg/m L、128mg/m L、64mg/m L的山銀花黃芩提取物溶液。同法制得濃度為12 mg/m L的阿司匹林溶液,4℃備用。
  
  將50只清潔級昆明種小白鼠置于室溫(22~25℃),相對濕度為65%±5%,12h明暗交替照明,自由進食、自由飲水的條件下飼養。隨機分為5組,每組10只,雌雄各半,分別為模型對照組、陽性藥物組和山銀花黃芩提取物高、中、低劑量組。模型對照組不給藥,陽性藥物組和山銀花黃芩提取物低、中、高劑量組每天分別用阿司匹林溶液和山銀花黃芩提取物低、中、高濃度的溶液對小鼠灌胃,劑量為0.5m L/20g,對照組灌胃同等體積的飲用水。連續給藥7d.末次給藥40min后,各組小鼠右耳內外涂以二甲苯20?l致炎,左耳作為對照,1h后將所有小鼠脫頸處死,沿耳廓根部剪下兩耳,用打孔器(直徑6mm)取下相同位置耳片,稱重,以左右耳片的重量之差作為腫脹度,算出腫脹率(%)。
  
  腫脹率(%)=(右耳重-左耳重)/左耳重×100%2.2.1.2山銀花黃芩提取物體外抑菌試驗(1)供試菌和山銀花黃芩提取物供試品溶液的制備將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌接種到營養瓊脂平板上劃線接種,37℃培養,待細菌達到對數期時將典型的單個菌落接種在營養瓊脂培養基斜面上傳代,傳至3代后的菌種即可作為供試菌種。將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的菌懸液分別進行活菌計數,用營養肉湯稀釋成含菌約105~106個/m L的菌液,制為供試菌液。
  
  精確稱取山銀花黃芩提取物5g,加去離子水溶解(以氫氧化鈉溶液調p H值至7.0),溶解后過濾,濾液置于50ml容量瓶中,用去離子水定容,3000r/min離心5min取上清液,用0.22?m的濾器過濾除菌,得到的山銀花黃芩提取物溶液濃度為100mg/m L,4℃備用。
  
  (2)山銀花黃芩提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的體外抑制作用取24支試管,分兩組,每組12支試管,編號依次為1~12,按無菌操作法在2~12號試管中分別用移液管加入2m L營養肉湯培養基,再用移液管吸取山銀花黃芩提取物溶液(100mg/m L)2m L放入每組的第1管和第2管,反復搖勻;從兩組的2號管吸取2m L放入第3號管……,依次倍比稀釋至9管,吸出2m L棄去,藥物濃度則依次為100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39mg/m L.第10號管中加入氧氟沙星溶液,使其作為陽性對照,最終濃度為1.6?g/m L,第11號管作為陰性對照,第12號管作為空白對照,然后將0.1m L供試菌液分別加入兩組試管的第1~11號管。置各試管于37℃培養箱中培養24h,觀察細菌生長情況。如試管為渾濁,表示細菌已生長,該管濃度的藥物無抑菌作用;如試管澄清,表示細菌生長受到抑制,則該管藥物有抑菌作用,能抑制細菌生長的最低藥物濃度作為山銀花黃芩提取物的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)。
  
  2.2.1.3山銀花黃芩提取物體內抗感染試驗
  
  (1)山銀花黃芩提取物溶液及菌液的制備分別劃線培養大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的菌株,挑選典型菌落接種普通肉湯瓊脂培養基,37℃培養18~24h,連續傳代3次,取菌落用普通肉湯培養基制成大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液。同時制得濃度為256mg/m L、128mg/m L、64mg/m L的山銀花黃芩提取物溶液和32mg/m L的氧氟沙星可溶性粉溶液。
  
  (2)體內抗感染預試驗按無菌方法操作,將制備好的菌液用麥氏計數法分別制成1013、1012、1011、1010、109、108、l07、106cfu/m L的不同濃度大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌液。將不同濃度的菌懸液分別腹腔注射體重20±2g的小鼠,每個濃度組5只小鼠,每只0.5m L/20g,記錄7d內小鼠的死亡情況,分別找出大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌液的最小致死量(minimum lethal dose,MLD),即感染后引起小鼠100%死亡的菌液濃度。
  
  (3)體內抗感染試驗將小鼠分5組,即山銀花黃芩提取物低濃度組(64mg/m L)、中濃度組(128mg/m L)、高濃度組(256mg/m L)、氧氟沙星組(32mg/m L)、空白對照組。每天用山銀花黃芩提取物低、中、高濃度溶液、氧氟沙星溶液對小鼠灌胃,劑量為0.5m L/20g體重,空白對照組灌胃同等體積的飲用水。灌胃7d后,以預實驗所得最小致死量的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌濃度的菌液給各組小鼠腹腔注射感染,每只注射0.5m L/20g體重。注射菌液后第1h及6h,對各組小鼠分別再灌胃上述低、中、高濃度的山銀花黃芩提取物溶液和氧氟沙星溶液,對照組小鼠灌胃同體積的飲用水,記錄7d內小鼠的存活天數和死亡情況(小鼠在第1、2、3、4、5、6、7d死亡的,小鼠的存活天數分別記為0、1、2、3、4、5、6,7d內未死亡的記為7)。
  
  2.2.2山銀花黃芩提取物安全性試驗
  
  2.2.2.1山銀花黃芩提取物急性毒性試驗

  
  將30只SD大鼠隨機分成3組,每組10只(雌雄各半),每次取1組進行試驗,重復3次,將山銀花黃芩提取物用蒸餾水配制成0.5g/m L的混懸液,經口對SD大鼠進行灌胃,灌胃體積為2m L/100g體重。給藥后觀察大鼠的一般表現、中毒癥狀和死亡情況,并對死亡大鼠進行剖檢,做好記錄。觀察時間為1周。
  
  將30只清潔級昆明種小鼠隨機分成3組,每組10只(雌雄各半),每次取1組進行試驗,重復3次,將山銀花黃芩提取物用蒸餾水配制成最大濃度為0.5g/m L的混懸液,經口對清潔級昆明種小鼠進行灌胃,灌胃體積為0.4m L/10g體重。觀察小鼠的一般表現、中毒癥狀和死亡情況,并對死亡小鼠進行剖檢,做好記錄。觀察時間為1周。
  
  2.2.2.2山銀花黃芩提取物臨床推薦劑量研究
  

  為了確定山銀花黃芩提取物的臨床推薦劑量及進行靶動物安全性試驗,試驗選取1日齡AA+肉雞120只,隨機分成6組,每組20只,分別為山銀花黃芩提取物1、2、3、4、5組和空白對照組。山銀花黃芩提取物1、2、3、4、5組分別在飼料中以0.25g/kg飼料、0.375g/kg飼料、0.50g/kg飼料、0.625g/kg飼料、0.75g/kg飼料的劑量添加山銀花黃芩提取物,連用42d;空白對照組正常飼喂(無藥物添加)。試驗期間記錄各組肉雞的采食量,每日稱體重,計算平均日增重、平均日采食量、料重比以及死淘率。
  
  平均日增重(ADG)=[總末重-(初始總重-初始均重×死淘只數)]/[試驗天數×(試驗只數-死淘只數)]平均日采食量(ADFI)=總耗料/(試驗天數×試驗末只數+死淘飼養天數×死淘只數)料重比(F/G)=飼料消耗量(kg)/增重(kg)死淘率=發病和死亡雞數量/試驗雞只數×100%

  2.2.2.3山銀花黃芩提取物靶動物安全性試驗

  為了研究山銀花黃芩提取物對肉雞臨床用藥的安全性,本研究將120只1日齡愛拔益加(AA+)肉雞隨機分為4組,每組30只,分別為山銀花黃芩提取物5倍、3倍和1倍臨床推薦劑量組和空白對照組。山銀花黃芩提取物5倍、3倍和1倍劑量組分別將山銀花黃芩提取物以2.5g/kg飼料、1.5g/kg飼料和0.5g/kg飼料的劑量混飼,空白對照組正常飼喂,連續給藥50d.試驗期間觀察各組試驗雞的一般體征、生長性能、免疫器官指數及臨床剖檢情況。
  
  2.2.3山銀花黃芩提取物對肉雞生長的研究
  
  2.2.3.1實驗動物分組及飼喂程序

  
  選用180只1日齡愛拔益加(AA+)肉仔雞公雛隨機分配到3個組,分別為空白對照組(無添加劑組),陽性對照組(博落回散)以及山銀花黃芩提取物組,每個組設6個重復,每個重復10只雞。基礎日糧參照NRC(1994)和中國雞飼養標準(NY/T-33-2004)配制。試驗期42d.采用立體網上養殖。山銀花黃芩提取物組在基礎日糧中添加量為500g/t.試驗盡量使每個重復分開,3個組的各重復均勻分布于控制溫度的雞舍內。基礎日糧組成及營養含量見表2-1;飼料原料相同。采用冷壓制粒,以顆粒料形式飼喂。自由采食,自由飲水。每日清晨8:30和下午2:30分別記錄雞舍溫度和濕度,定時清掃衛生。每周結料一次,以重復為單位對雞稱重一次,記錄增重、采食量、死亡數等基本數值。

  
  2.2.3.2生長性能測定
  
  分別于1、21日齡和42日齡以重復為單位整體稱重,計算平均日增重、平均日采食量、料重比以及死淘率。
  
  平均日增重(ADG)=[總末重-(初始總重-初始均重×死淘只數)]/[試驗天數×(試驗只數-死淘只數)]平均日采食量(ADFI)=總耗料/(試驗天數×試驗末只數+死淘飼養天數×死淘只數)料重比(F/G)=飼料消耗量(kg)/增重(kg)死淘率=發病和死亡雞數量/試驗雞只數×100%2.2.3.3血液理化指標測定分別于 21 和 42 日齡,各組以重復為單位隨機選 1 只肉雞,翅靜脈采血 3 m L,促抗凝管存放,自然析出血清后將血清移至離心管中,離心 10 min,轉速 3000 r/min,上清液分裝于1.5 m L eppendof 管中,置-30℃冰箱保存待用。
  
  血液脂質代謝指標:總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量、甘油三酯(TG),采用南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定,嚴格按照說明書進行操作。
  
  血液抗氧化指標:總抗氧化力(T-AOC)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD),南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定,嚴格按照說明書進行操作。
  
  2.2.3.4免疫指標測定
  
  ①血清溶菌酶(LZM)含量21 和 42 日齡,各組以重復為單位隨機選 1 只肉雞,從翅靜脈采血,并離心制備血清,冷凍(-20 ℃)待測。按 Kreukniet 等(1994)方法,測定血清溶菌酶活性,用溶壁微球菌細胞作為底物。
  
  ②免疫器官指數分別在 21 和 42 日齡頸部放血屠宰雞 1 只,摘除脾臟、胸腺、法氏囊,稱重,計算占體重之比。器官指數=器官重量(g)/活體重(kg)×1000.
  
  ③免疫球蛋白測定21 和 42 日齡,測定血清免疫球蛋白。免疫球蛋白 G(Ig G)、免疫球蛋白 M(Ig M)、免疫球蛋白 A(Ig A)采用雙抗夾心酶聯免疫吸附法(ELISA),采用市售試劑盒測定。
  
  2.2.3.5腸道形態
  
  于 42 日齡,以重復為單位隨機選取 1 只體重接近該重復平均值的肉仔雞,進行屠宰,剝離出十二指腸和空腸,緩緩的用冰冷的生理鹽水沖洗干凈,浸入 p H=7.4 的福爾馬林溶液,保存在 4℃冰箱,以備制作石蠟切片。采用甲苯胺藍法染色,在光學顯微鏡下觀察,每個切片隨機抽取 5 個非連續性視野,每個視野統計 3 組數據,測絨毛高度、隱窩深度,計算絨毛高度/隱窩深度(VCR)。絨毛長度是指絨毛頂端到絨毛基部的長度,隱窩深度是指腸腺底部到兩絨毛之間基部開口處的距離。
  
  2.2.3.5數據統計分析
  
  數據以平均數±標準差表示。采用SPSS(15.0)軟件的ONE-WAY ANOVA對各組先進行方差齊次性檢驗,再進行F檢驗和Duncan氏多重比較。
對應分類:
版權所有:上海論文網專業權威的論文代寫、論文發表的網站,秉承信譽至上、用戶為首的服務理念,服務好每一位客戶
本站部分論文收集于網絡,如有不慎侵犯您的權益,請您及時致電或寫信告知,我們將第一時間處理,郵箱:shlunwen@163.com
ibb娱乐彩票
<meter id="7xttx"></meter>
  1. <code id="7xttx"><delect id="7xttx"><p id="7xttx"></p></delect></code>
  2. <acronym id="7xttx"></acronym>

    <address id="7xttx"></address>
    青铜峡市| 天门市| 宁德市| 文化| 镇赉县| 社会| 密山市| 晴隆县| 西乡县| 宁强县| 八宿县| 务川| 西丰县| 娱乐| 明溪县| 长白| 沙雅县| 讷河市|